精確的基因組編輯可對活細胞中的DNA進行精確修飾，從而為植物育種提供了廣泛的機會。由David R. Liu教授和他的同事開發的主要編輯器允許在所需的目標站點中安裝所需的編輯。它們由工程改造的Cas9切口酶(H840A)-逆轉錄酶(RT)融合蛋白和主要的編輯指南RNA(pegRNA)組成。

科學院遺傳與發育生物學研究所(IGDB)的高才霞教授和其他學者一起，將主要編輯器開發和優化為一種極其通用的編輯策略，以在水稻和小麥中產生可編程的點突變，插入和缺失，以及她的研究團隊和合作者。

他們發現，植物主要編輯器的編輯效率受到PBS和RT模板序列的強烈影響，表明需要優化的pegRNA設計以產生更高的產物轉化率。

為了確定有效的引物編輯的原則，IGDB的高教授和李嘉陽教授及其研究團隊還報告了優化的pegRNA設計策略，這些策略可以最大程度地提高植物的引物編輯效率。

由于引物結合位點(PBS)與非靶鏈ssDNA的雜交是逆轉錄的第一步，因此研究人員假設PBS序列的解鏈溫度(Tm)(以下稱為PBS Tm)為對于主要編輯者來說很重要的參數。通過分析水稻原生質體中18個內源目標位點的主要編輯效率，他們發現PBS Tm強烈影響編輯效率，當水稻中PBS Tm為30°C時最大的主要編輯發生。

除了確定最佳的pegRNA設計之外，他們還介紹了通過使用雙pegRNA進行主要編輯的進展。此策略依賴于兩個pegRNA，它們產生各自的ssDNA襟翼，這些襟翼以反式彼此堿基對，同時在新合成的DNA的兩條鏈上編碼相同的編輯。

與單獨使用單個pegRNA相比，這種新的編輯方法使主要編輯效率平均提高了3.0倍。此外，科學家們產生了由SpG(具有擴展的PAM靶向范圍的工程Cas9)組成的主要編輯器，以擴展這種雙重PegRNA編輯策略的靶向范圍。在一起，優化PBS Tm并使用雙重PegRNA策略可將水稻的主要編輯效率提高到17.4倍。

基于這兩項進步，團隊開發了一個用戶友好的Web應用程序PlantPegDesigner，以幫助其他研究人員設計最適合其應用程序的主要編輯工具。

PlantPegDesigner為用戶提供了靈活性，并可以根據他們的個人需求控制各種參數。該工具推薦間隔物-PAM序列，PBS序列，RT模板序列，以及用于構建載體的PCR克隆引物。與其他Web應用程序相比，PlantPegDesigner推薦的雙pegRNA在水稻中的編輯活性提高了46倍。

總而言之，這項工作簡化了pegRNA的設計，從而為在植物中進行有效的引物編輯提供了可靠的解決方案。優化的植物原始編輯系統的靈活性將促進植物育種和功能基因組學研究。

這項名為“在植物中使用優化的配對pegRNA進行高效引物編輯”的研究于3月25日在線發表在《自然生物技術》上。